Сыроежки, подгруздки, валуй

[=SM= 26 126]

6 минут назад, erlin сказал:

А как с этим быть?

А никак. Это единственное, что не подходит. Но в сравнении с остальными это самое меньшее расхождение. Я исхожу из того, что оставшиеся две отпали до конца. А есть еще варианты? А найти новый вид было бы неожиданно. Хотя ради этого можно и в секвенатор...

 

[erlin 3 444]

1 час назад, =SM= сказал:

Это единственное, что не подходит

Ну и споровый отпечаток у тебя еле-еле касается. У renidens - Il (b) c-d.

[=SM= 26 126]

@erlin 

Ну черт его знает... Тогда можно навреное и сходить их набрать-насушить побольше. Запротоколировать реакцию на гваяк... (FeSO4 есть) А вдруг... Правда в чудеса не очень верится.

[=SM= 26 126]

Вот так они посерели от влаги, которой еще лило и лило.

[Игорь Лебединский 10 416]

Вот под забором выросли мелкие хрупенькие сыроежки "без особых примет". Запаха нет, вкуса нет, остроты в пластинках нет. Единственное что (не попало в кадр) пластинки немного желтовато-кремовые, желтоватей, чем в среднем сыроежке положено. Из микоризных деревьев - только средневозрастная ель.

 

[erlin 3 444]

15 часов назад, Игорь Лебединский сказал:

пластинки немного желтовато-кремовые, желтоватей, чем в среднем сыроежке положено

Возможно - Russula nauseosa или кто-то другой из Laricinae, может и laricina.

[Карен 8]

Приветствую всех. Коллега Erlin недавно основательно прокомментировал некоторые фотографии камчатских грибов у меня на сайте и, помимо нескольких неправильных определений (как же без этого  ) указал на несколько видов, в том числе сыроежек, которые не определяются, и в принципе могут быть новыми. Удержаться, естественно, невозможно, надо секвенировать. Возможность такая найдена. Возможно кто-нибудь знает, есть ли какие-то специфические правила подготовки свежесобранных грибов для последующего секвенирования? Отдаем сухой материал? Может сушить надо как-то по особому (скажем при температуре не выше скольких-то градусов)? Или промораживать перед высушиванием чтобы убить насекомых? Или промораживание только попортит материал? Или кусочек отрезаем и в силикагель (так делают наши альгологи)? Или может в спирте фиксируем кусочек (так делают зоологи)? Если кто в курсе и что еще может посоветовать - буду благодарен любым советам.

Изменено 05.11.2022 00:14 пользователем Карен

[=SM= 26 126]

9 часов назад, Карен сказал:

Возможно кто-нибудь знает, есть ли какие-то специфические правила подготовки свежесобранных грибов для последующего секвенирования? Отдаем сухой материал?

 

Сушить, в первую очередь, надо так, чтобы никакие частицы одного материала не попали в другой - сушилка должна быть без вентилятора, если образцов несколько, (я сушу на столе, который над нагревателем-конветкором). Грибы, если они не "из одной плотной кучи", должны лежать на расстоянии, и разделены друг от друга, или согнутой бумагой, или в картонных коробочках, или еще как то так. Иначе, если даже споры достаточно налетят из одного экземпляра в другой, может получиться или "ложная" гетерозиготность, или вообще ничего не получиться - будет неинтерпретируемый набор пиков на хроматограмме. Хранить тоже желательно так, чтобы грибы не соприкасались, даже если это предположительно один вид, но росли не сростком. При хранении очень следить за влажностью в месте хранения, не дай бог плесень, это сразу испорченный для секвенирования образец (смесь из двух грибных ДНК даст заведомо неинтерпретируемый результат, так как как-то просто праймерами плесень не отсеять).

Температура - не выше 70 градусов (в ПЦР - в районе 70-72 градуса происходит элонгация, отжиг праймера - в районе 60 градусов - а значит для ДНК эти температуры проблем не создают). Денатурация происходит в районе 90 градусов.

Отдаем сухой материал, достаточно кусочка со спичечную головку, но много не мало. При отправке я их раскладываю по пробиркам Эппендорфа, и на каждую делаю наклейку с номером образца.

Насчет проморозки - я не промораживал. Но у меня были случаи, когда гриб сжирали до высыхания, если я ничего не делал. Как по мне - нагрев до 50-60 градусов убивает там всех без вариантов, поэтому подозрительные на личинок грибы отправляются сначала в сушилку с вентилятором на минут 40 на 60 градусов, а потом уже на стол. Но по отдельности, один гриб один заход, чтобы не налетело, и мойка поддона перед тем, как.

 

Для примера - вот эти сыроеги были высушены именно так, с часом в сушилке, ибо черви их не просто любят, а очень любят - https://forum.toadstool.ru/topic/6020-russula-ustulata/?tab=comments#comment-527553 И с ними все отсеквенировалось на отлично (и кстати подтвердило предварительное немного сомнительное определение по микропризнакам).

 

И требуйте потом хроматограммы (файлы .ab1), а не просто сиквенс из букв. Там бывают нюансы, требующие ручной правки.

 

[Карен 8]

18 минут назад, =SM= сказал:

 

Сушить, в первую очередь, надо так........

Понятно, спасибо большое, сухой материал на секвенирование отдавать еще не приходилось, поэтому надо было уточнить, особенно насчет температуры сушки. Да, ПЦР при высоких температурах проводят, но к примеру фиксированный зоологический материал для ПЦР стараются все же хранить в холодильнике, сомневался можно ли в тепле сушить.

 

Цитата

Как по мне - нагрев до 50-60 градусов убивает там всех без вариантов, поэтому подозрительные на личинок грибы отправляются сначала в сушилку с вентилятором на минут 40 на 60 градусов, а потом уже на стол.

Хорошая мысль, мне не приходило в голову, спасибо!

 

Пользуясь случаем, Вы в этой теме периодически упоминаете гвайяк, где Вы его берете? Все грибные реактивы есть, а где взять гвайяк (ну так, чтобы было до кучи), не могу придумать.... что это такое вообще?

[=SM= 26 126]

2 часа назад, Карен сказал:

Пользуясь случаем, Вы в этой теме периодически упоминаете гвайяк, где Вы его берете?

Когда еще можно было покупать в Германии, купил пузырек в интернет-магазине Андреаса Гминдера.

Это раствор смолы гваякового дерева в спирте (не путать с гваяколом - некой вытяжкой из него - не так работает).

 

[=SM= 26 126]

@Карен 

И еще раз на всякий случай обращу внимание - главное - избегайте поражения грибами. Так как черви, растительность, мхи и прочее отсеивается праймерами (если, для примера, для участка ITS1-5.8S-ITS2 прямой применять ITS1F (5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'), обратный - ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')), которые "стандартные" у синтола (я там делал - контора очень адекватная)). То есть, даже если черви сожрут пол-гриба, но останутся например пластинки, даже края, то секвенирование будет удачным, так как неинтересные участки не будут амплифицированы. Если же гриб поразит другой микофильный гриб, то кирдык - или вообще полный, или клонировать, или разрабатывать особые праймеры.

И еще - самая лучшая часть гриба для секвенирования - это гименофор с субгимением, там наиболее большое число компактных клеток, содержащих максимальное количество нужных ДНК.

 

И еще шкурный вопрос. Если у вас дешевле, чем 2000р/образец с этими праймерами, и есть опыт, дающий хорошие результаты, я бы присоединился, у меня есть образцов в планах.

[Карен 8]

В свете сказанного вами, возможно имеет смысл прямо в поле отрезать маленький кусочек от шляпки и в пробирку с силикагелем - исключается загрязнение другими грибами, плесень и прочее. Видел что так делают альгологи в море - все растение разу после сбора в гербарий, маленький кусочек от него (веточку 5 мм) в пробирку с силикагелем на молекулярку. Знаю так же случай, когда коллега уехав за границу и забрав с собой свой водорослевый гербарий не смогла там ничего из него отсеквенировать, не пошли сиквенсы, хотя сушилось все по правилам, как обычно.

 

4 часа назад, =SM= сказал:

И еще шкурный вопрос. Если у вас дешевле, чем 2000р/образец с этими праймерами, и есть опыт, дающий хорошие результаты, я бы присоединился, у меня есть образцов в планах.

Не могу ответить вам в личку через этот форум (видимо у меня мало сообщений и личные сообщения отключены), напишите мне на емайл (coralreef@sanamyan.com), расскажу ситуацию.

[=SM= 26 126]

10 часов назад, Карен сказал:

В свете сказанного вами, возможно имеет смысл прямо в поле отрезать маленький кусочек от шляпки и в пробирку с силикагелем - исключается загрязнение другими грибами, плесень и прочее.

Ну во первых не исключается, спор микофилов и в лесу предостаточно, и в пробирке им живется не хуже. Вообще, наверное, способ имеет право на жизнь, но я не уверен, что силикагель хорошо и быстро вытащит влагу из кусочка гриба. Для микологии это необычный способ, нигде вроде не описанный. Обычно собирают в контейнеры, потом делают отсев спор, если надо (для сыроег надо - цвет отсева в массе это диагностический признак), потом сушат...

[Карен 8]

 

06.11.2022 в 20:42, =SM= сказал:

для сыроег надо - цвет отсева в массе это диагностический признак

Хотел сказать спасибо Сергею Маркову за RAW фотографию шкалы цветов спор сыроежек, позволило более-менее понять какие на ней (на данной конкретной шкале) реальные цвета. У меня есть возможность напрямую замерять цвет отпечатков спор на бумаге, так что сопоставление цветов со шкалой, в теории, не должно быть проблемой. На практике все оказалось сложнее. В итоге, влез я во всю эту колориметрию сильнее чем требуется, тема затянула. Написал для себя маленькую утилиту, сравнивает цвет отпечатка со шкалой (в принципе с любой), называет наиболее близкую плашку (или плашки) на шкале с указанием степени визуального отличия (именно визуального) в числах. Но это так, между делом. 

В общем, если считаете, что все это не нужные тонкости и сложности, то не будем тратить время.  

Но если кому-то интересно, можно обсудить вопросы связанные с цветом спор (определение цвета отпечатка, сравнение со шкалами, зависимость от толщины слоя спор и от использованной в качестве подложки бумаги, насколько варьирует от экземпляра к экземпляру, как меняется со временем и так далее). Наверное не в теме про сыроежки, но новые темы мне движок форума не дает создавать. 

[erlin 3 444]

05.12.2022 в 05:02, Карен сказал:

сравнивает цвет отпечатка со шкалой

Хочу понять.

Вы распечатали шкалу?

Или Ваша утилита сравнивает фото споровых отпечатков с фото шкалы?

[=SM= 26 126]

@erlin 

Там все куда серьезнее, у него есть спектрофотометр, на сколько я понял, тот самый Eye One, которым моя цветовая шкала промерена, и он может непосредственно измерять цвет самого отсева прямо прибором.

 

Но мне видится это излишним, так как цвет отсева "гуляет" сам по себе значительно, и на одну ступень может выходить за описания с легкостью, и поэтому визуальное сравнение по-моему достаточно.

[Карен 8]

17 часов назад, erlin сказал:

Вы распечатали шкалу?

Или Ваша утилита сравнивает фото споровых отпечатков с фото шкалы?

 

Нет, мне распечатывать ее нет необходимости. Из присланного рав файла, после профилирования и доводки вручную вытащил усредненные цветовые значения (L*a*b) всех плашек, мне этого достаточно. Конечно, напрямую замерить оригинальную руссулярную шкалу было бы сильно лучше, но по понятным причинам, такой возможности не было.

 

Программа сравнивает не фото, вручную вводим цвета Lab спорового отпечатка. Я могу его измерить напрямую и точно. Можно и из фотошопа брать, при соблюдении некоторых условий точность будет хорошая. И рассчитывает "визуальную дистанцию" deltaE 2000 (там очень громоздкие формулы) от цвета плашек на руссулярной (например) шкале. Утилита эта не самоцель, сначала набросал ее только с целью понять, что не так с руссулярной шкалой (а там есть странности), собственно всего один день потратил, благо готовые алгоритмы есть в свободном доступе (на сайте https://cielab.xyz ).

Возможно (не уверен, но некоторая вероятность есть), получится понять на какие параметры цвета смотреть, чтобы можно было точно идентифицировать его с конкретной плашкой на  шкале, даже если спор высыпалось мало и отпечаток сильно светлее, чем надо. Возможно надо рассчитывать разницу учитывая, например, только цветовой тон, или тон + насыщенность цвета (без учета светлоты),  в теории это должно убрать зависимость от концентрации "красителя", но как оно на практике надо смотреть (летом). 

[Карен 8]

15 часов назад, =SM= сказал:

@erlin

у него есть спектрофотометр, на сколько я понял, тот самый Eye One, которым моя цветовая шкала промерена, и он может непосредственно измерять цвет самого отсева прямо прибором.

Да, он его купил в незапамятные времена для калибровки монитора, когда доллар было 30р. В итоге нашлась масса применений (например спектры светильника над морским аквариумом настраивать), а вот цвет спор инструментально померить в голову пришло только сейчас, когда грибы кончились. Теперь до лета ждать.

 

15 часов назад, =SM= сказал:

Но мне видится это излишним, так как цвет отсева "гуляет" сам по себе значительно, и на одну ступень может выходить за описания с легкостью, и поэтому визуальное сравнение по-моему достаточно.

Так ведь и степень "гулянья" можно померить... Но, ок, излишне, так излишне, тогда и обсуждать смысла нет.

 

[Cook 3 619]

Эту сыроежку нашел в сентябре, в смешанном лесу. Не помню уже, какой у нее вкус. По внешним признакам можно предположить вид?

 

[Юкош 6 295]

@Cook Это пищевая, Russula vesca.